桑黄胞内多糖抗肿瘤效应的实验研究

本文转自《 癌变 畸变 突变》2007年第四期

沈业寿／郑立军／王正亮／顾利平

(安徽大学生化微生物研究所糖复合物与糖工程实验室，安徽合肥230039)

    【关键词】桑黄；胞内多糖；S180；抗肿瘤：免疫

【摘要】背景与目的：探讨桑黄胞内多糖的抗肿瘤和增效作用以及对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响，为开发桑黄胞内多糖提供理论依据。材料与方法：采用s180荷瘤小鼠，随机分为正常对照组，荷瘤对照组，环磷酰胺(cP)组，桑黄胞内多糖低、中、高剂量组(50、100、200 mg／kg)和CP与桑黄胞内多糖低、中、高剂量联合用药组共9组，每组10只。分别观察桑黄胞内多糖及与cP联合用药后的抑瘤效果及对荷瘤小鼠免疫功能的影响，采用MTT法测定对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响。结果：200、100 mg／kg剂量的桑黄胞内多糖对S180的抑制率分别为57．02％和61．40％；与环磷酰胺联合使用后，100mg/kg的剂量抑制率可达79．51％；联合用药组荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显增加(P<0．05)，显示其对环磷酰胺造成的免疫器官损伤有明显的保护作用；桑黄胞内多糖组及其与CP联合用药组白细胞数(OD值)均较荷瘤组和CP组高(P<O．05或P<0．01)，显示桑黄胞内多糖对CP造成的白细胞数下降有明显的拮抗作用，具有促进机体白细胞生成能力；桑黄胞内多糖对s180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的转化具有明显的促进作用。

结论：桑黄胞内多糖有明显的抗肿瘤作用，明显增强荷瘤小鼠免疫功能，并能降低化疗药物造成的免疫系统损伤，对环磷酰胺起增效减毒作用。  

 癌症是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，目前使用的化疗药物对人体都有一定的毒副作用。桑黄(Phellinus linteus)属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科的真菌，是目前国际上公认的生物抗癌物质中有效率排在第1位的药用真菌【1】。桑黄因其特有的药用功能，已经成为国内外抗癌研究的热点。但其子实体价格昂贵，人工栽培周期长、难度大，这就使得桑黄发酵的研究显得尤为重要。用发酵菌丝体取代子实体将是桑黄研究、应用的必然方向。因此我们研究桑黄胞内多糖的抗肿瘤作用和对环磷酰胺(CP)的增效作用以及对S180荷瘤小鼠免疫功能的增强作用，为寻找一种新型低毒高效的抗肿瘤药物和抗肿瘤增敏剂提供原料。

  1  材料与方法

  1．1  材料4．6302桑黄菌菌株由安徽大学糖复合物与糖工程实验室提供。胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMIl640培养基、MTT(Gibco公司)，二甲基亚砜(中国医学科学院

生物工程研究所)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，S180细胞株由中国科学院上海细胞库提供。实验动物为昆明种小鼠，体重20～24g，雄性，安徽医研所提供，合格证号：皖医实动准第0l号。

   1．2  实验方法

   1．2．1  桑黄胞内多糖的制备  由液态发酵菌丝体按常规方法提取制备【2】。

   1．2．2  桑黄胞内多糖对小鼠肉瘤$180的抑制实验【3-4】小鼠随机分为正常对照组，荷瘤对照组，CP组，桑黄胞内多糖低、中、高剂量组(50、100、200 mg／kg)，CP与桑黄胞内多糖低、中、高剂量联合用药组，共9组，每组lO只。S180细胞株在小鼠体内常规接种传代3次后，无菌条件从腹腔中抽取乳白色瘤液，显微镜下台盼蓝排除法计数活细胞数>95％，用生理盐水稀释至1 ×107／ml。除正常对照组外，其余8组小鼠右腋下作常规消毒后皮下接种上述瘤液，每只0．2 ml，饲养24 h后开始灌胃给药。正常对照组和荷瘤组生理盐水灌胃每只0．2 ml；CP组腹腔注射CP 10 mg／kg；桑黄胞内多糖组每只分别灌胃桑黄胞内多糖0．2 ml。每3 d称一次体重。连续给药2周。末次给药后禁食12 h，小鼠(除对照组外，其余各组均要求右腋部有肿块生长，肿块表面皮肤无破溃，未出现胸水)称重，断髓处死后，取胸腺、脾脏、剥离局部肿块，称重，按下式计算抑瘤率。肿瘤抑制率(％)：(C—T)／C x 100%式中C为对照组平均瘤重，T为实验组平均瘤重。两药给药后是否增效，按下式计算q值：

    q=EAB／[EA+(1一EA)EB]

    式中的EA为A药的抑瘤率, EB为B药的抑瘤率，EAB为两药合用时的抑瘤率，．以q=0．85～1．25为两药作用相加，q<O．85为两药拮抗。

    1．2．3  免疫脏器指数的测定取胸腺、脾脏称重后，按下式公式计算胸腺指数和脾脏指数：

    胸腺指数=实验组小鼠胸腺重量／实验组小鼠体重

    脾脏指数=实验组小鼠脾脏重量／实验组小鼠体重

    1．2．4  S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖活性  采用MTT比色法【5-6】，小鼠分组给药同1．2．2，实验结束后，无菌取脾，加Hanks液低温研磨，200目筛过滤加入等量红细胞消除液溶胀红细胞，振荡，低速离心，弃上清，Hanks液洗一次，RPMll640培养液洗涤2遍，均离心。细胞计数，将淋巴细胞浓度调至l ×10⁷／ml。每组小鼠淋巴细胞悬液取100 ul于96孔板中，设3个复孔。置C0₂培养箱中37 ℃、5％C02、饱和湿度条件下培养48 h后取出，离心，弃上清，每孔加入MTT(5 mg／ml)20ul，C0₂培养箱中继续培养4 h。再取出，离心，弃上清，加入DMSO100ul，振荡混匀，酶标仪570 nm处测吸光度(A)。

    1．2 . 5  白细胞计数小鼠分组给药同1．2．2，灌胃给药2周后，小鼠尾部取血20ul于EP管中，加入0．38 ml白细胞稀释液，混匀，取10ul加入白细胞计数板上，盖上盖玻片，倒置显微镜下计数白细胞。

    1．3统计学方法

    采用SPSSl0．O软件对数据作t检验，单因素方差分析和相关性分析。

    2  结果

    2．1  桑黄胞内多糖的抗肿瘤作用及对环磷酰胺增效作用200、100 mg／kg剂量的胞内多糖对S180有着明显的抑制作用，与CP联合使用时，50、100 mg／kg剂量的q值

均大于O．85，抑制率都在70％以上，且100 mg／kg联合用药组的抑制率(79．51％)与CP组(67．98％)相比差异有统计学意义(p<O．05)，说明桑黄胞内多糖对CP有明显的增效作用。

2．2                     桑黄胞内多糖对S180荷瘤小鼠体重及免疫脏器的影响 ,由表2可知CP组与荷瘤组相比，、胸腺指数与脾脏指数均有显著差异(p<O．01、P<O．05)，说明CP对机体免疫系统具有较大的毒副作用。胞内多糖各剂量组与荷瘤组相比，脾脏指数明显增加(P<O．05)，胸腺指数无明显

差异(P>O．05)，说明其对机体的免疫器官具有功能受到抑制，导致CP组小鼠存活数下降；然而桑黄胞内多糖各实验组的胸腺指数、脾脏指数较荷瘤小鼠升高，联合用药各组亦比CP组小鼠明显提高(P<O.Ol或 P<O．05)；实验结果还显示桑黄胞内多糖能明显增加荷瘤小鼠的白细胞数，促进白细胞生成，并对CP引起的小鼠白细胞数下降有明显的拮抗作用；同时，桑黄胞内多糖还能增强小鼠脾淋巴细胞增殖能力，对CP造成的脾淋巴细胞转化能力的下降有明显的拮抗作用。可见桑黄胞内多糖具有较强的免疫增强活性，其抗肿瘤机理也许就在于此，但其确切机制还待进一步深人研究。保护作用。胞内多糖各组与CP组相比，脾脏指数和胸腺指数均明显增加(P<0．01、P<0．05)，联合用药组免疫脏器指数较CP组均显著增加(P<0．01、P<0．05)。

2．3                     桑黄胞内多糖对S180荷瘤小鼠白细胞数和脾细胞增殖分化能力的影响

由表3可知，CP组白细胞数较荷瘤对照组明显下降(P<0．01)。桑黄胞内多糖各剂量组与荷瘤组相比，白细胞数明显提高，显示菌丝体多糖有明显的促进白细胞生成能力。联合用药组与CP组相比差异显著(P<0．01)，表明胞内多糖对CP造成的白细胞数下降有明显的拮抗作用。

    由表3可见，环磷酰胺组脾细胞增殖能力较荷瘤组明显下降(P<0．05)。桑黄胞内多糖各剂量组与荷瘤组相比、，脾淋巴细胞增殖能力有明显提高，说明菌丝体多

糖有明显的促进脾淋巴细胞转化能力。联合用药组与CP组相比差异具有统计学意义(P<0．01)，说明桑黄胞内多糖对CP造成的脾淋巴细胞转化能力的下降有明显的拮抗作用。且实验结果还显示CP在抑制肿瘤的同时，副作用大，小鼠死亡只数多，并伴有明显的皮毛粗糙，行动迟缓等现象。

 3  讨论

    CP是有效的细胞型抗肿瘤化疗药物，但也是一种经典的免疫抑制剂，在杀伤肿瘤细胞的同时，也损害机体免疫系统，出现白细胞数降低，免疫功能下降等不良反应。桑黄是目前报道的抗癌效果最好的真菌，其抗肿瘤方面的研究都集中在子实体多糖上，其机理是通过细胞调节和体液免疫来提高免疫力而抑制肿瘤细胞生长和转移【7】。本实验结果表明，桑黄胞内多糖也能有效抑制小鼠S180实体瘤，其200、100 mg／kg剂量组的抑制率分别达57．02％和62．4％；与CP联合使用后，100 mg／kg的剂量抑制率可达79．51％，其中50、200 mg／kg剂量的抑制率也均达70％以上，说明桑黄胞内多糖对CP有增效的作用。

    胸腺和脾脏是重要免疫器官，胸腺指数和脾脏指数的大小直接反映机体免疫水平的高低。小鼠化疗后CP作为广谱性的免疫调节促进剂，真菌多糖具有多种生物活性，其中一些已作为癌症的辅助治疗剂或抗病毒药应用于临床，并成为寻找新药的重要资源。本研究结果显示桑黄胞内多糖有较强的抗肿瘤作用及免疫增强活性，为开发成新型的抗肿瘤增敏剂和免疫增强促进剂奠定基础。

  参考文献：

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【5】薛庆善．体外培养原理与技术【M]．北京：科学技术出版社，

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