桑黄胞内多糖的抗突变和抗氧化作用

郑立军／沈业寿*／季俊虬／李宜明

(安徽大学生命科学学院糖复合物与糖工程实验室，安徽合肥  230039 )

《癌变  畸变  突变》杂志2006年第十八卷第六期

    【摘要】背景与目的：探讨桑黄胞内多糖抗环磷酰胺致突变作用。  材料与方法：选用小鼠50只，随机分为阴性对照组(0．86％生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺，CP)和桑黄胞内多糖不同剂量实验组(150、300、600 mg／kg)，采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和小鼠精子畸形实验，研究桑黄液态发酵胞内多糖的抗环磷酰胺致突变作用，并检测小鼠血清和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。  结果：150、300、600 mg／kg剂量的桑黄胞内多糖的微核抑制率分别为24．25％、53．36％和63．43％；各剂量组精子畸形率分别为(60．33±4．16)‰、(50．00±4．08)‰、(46．75±2．98)‰，CP组为(94．80±6．49)‰，各剂量组与CP组间的差异具有统计学意义(P<0．01)；桑黄胞内多糖能明显增强小鼠SOD活性，降低MDA含量；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与SOD活性呈明显负相关【r．血清=一0．998，r肝=-0．979，P均<0．05)，与MDA含量呈明显正相关(r 血清=O．997，r肝=0．989，P均<0．05)。 

结论：桑黄胞内多糖对由环磷酰胺引起的体细胞和生殖细胞的基因突变有着明显的拮抗作用。其机制可能与通过提高机体抗氧化防御系统的功能，防止有害自由基对细胞内生物大分子的损伤，抑制脂质过氧化的产物有关。

【关键词】桑黄；胞内多糖；微核实验；精子畸变；超氧化物歧化酶；丙二醛

    桑黄(phellinus igniarius)属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科的药用真菌，其药用最早记载于《本草纲目》中，是目前国际公认的生物抗癌物质中有效率排在第一位的药用真菌【1 】。桑黄因其特有的药用功能，已经成为国内外抗癌研究的热点，但对桑黄发酵菌丝体有关的药理研究还未见报道。为此我们通过测定血清和肝组织中超氧化物歧化酶（SOD)活性，丙二醛(MDA)含量的变化，研究桑黄胞内多糖抗环磷酰胺(CP)致突变作用。

 l  材料与方法

 1．1  供试菌株  4．2303桑黄菌菌株由安徽大学糖复合物与糖工程实验室提供。

 1．2  试剂  SOD试剂盒及MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所，环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，GiemSa染色剂为Sigma公司产品。

 1．3  实验动物  昆明种小鼠，体重20～24 g，雄性，安徽医研所提供。

 1．4  实验方法

 1．4. 1  桑黄胞内多糖的制备  按文献[2]中的方法提取制备。

 1．4．2  小鼠嗜多染红细胞微核实验  小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组(CP组)，桑黄胞内多糖低、中、高3个剂量实验组，共5组，每组各10只。阴性组、阳性组以0．2ml生理盐水灌胃；低、中、高剂量组分别灌以1 50、300、600 mg／kg不同浓度的胞内多糖稀释液0．2 ml，连续灌胃15 d。试验最后2 d，阳性对照组和3个实验组腹腔注射环磷酰胺40 mg／kg；实验组在注射环磷酰胺2 h后，再分别用胞内多糖稀释液O．2 ml灌胃。末次给药后6 h，处死小鼠，取一侧股骨，用小牛血清冲洗骨髓，混匀后直接推片，每只小鼠制片2张，编号。自然干燥后，甲醇固定，Giemsa．与磷酸缓冲液(pH6．8)1：10混合后染色【3】。采用双盲法计数，每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核(MN)数【4】，计算微核千分率(MN‰)并按下列公式计算抑制率：MN抑制率(％)=(阳性组MN数－实验组MN数)／阳性组MN数×100％    ，

 1．4．3  小鼠精子畸变实验小鼠按1．4，2实验分组，采用文献【5】的方法，其实验组分别经口灌胃胞内多糖稀释液O．2 m1，各相当于150、300、600 mg／kg的剂量，每天1次，连续7 d，第8 d起同阳性对照组经腹腔注射环磷酰胺(40 mg／kg)，每天1次，连续5 d；阴性组经口灌胃生理盐水，每天1次，连续5 d。给予CP后第35 d处死小鼠，按常规方法制片，每只动物检查完整精子1 000个。精子畸形的类型：有无钩、不定形、香蕉形、双头、双尾以及胖头。无尾精子、头部重迭的或整个精子与另一个重迭的均不计数。不同畸形精子分类计数后，计算每组精子畸形率(‰)。

 1．4．4  小鼠血清、肝组织中SOD、MDA含量测定动物分组及给药方式同实验方同1．4．2，末次给药后6 h，摘眼球取血，离心分离血清；另迅速取出肝脏组织，按常规方法制成10％的组织匀浆液(组织：0．86％生理盐水：l：9)。SOD活性、MDA．含量、组织蛋白含量的测定按试剂盒说明进行。

1．5  统计学方法  数据用χ±s表示，采用SPSS 10．0软件进行t检验，单因素方差分析，相关性分析。   

    2  结果

    2．1  桑黄胞内多糖对CP诱发的小鼠骨髓细胞微核率的影响  阳性对照组骨髓细胞微核率与阴性对照组的微核率差异具有统计学意义(P<0．01)，说明本实验系统是可靠的。由表1显示，实验组的微核细胞率与CP组比较差异均有统计学意义(P<0．05)；根据各组的微核数，计算出低、中、高剂量组的微核抑制率分别为24．25％、53．36％和63．43％抑制率成增加趋势，表明各组的微核发生率与胞内多糖剂量之间存在着剂量效应关系。  

2．2  桑黄胞内多糖对CP诱发的精子畸形率的影响  由表2显示，CP组精子畸形率较阴性组明显增加(P<(0．01)。高、中、低剂量桑黄胞内多糖组的精子畸形率显著低于CP组(P<0．01)，且随剂量增加，抑制越明显。而且胖头、双头或双尾等严重畸形的精子明显减少(见表2)。

    2．3  桑黄胞内多糖对CP所致小鼠脂质过氧化的影响  由表3可见，给予CP的阳性对照组SOD活性明显低于阴性对照组(P<0．01)。桑黄胞内多糖可显著增强血清和肝组织中SOD的活性，高剂量组SOD活性明显高于CP组(P<0．01)，中、低剂量组与CP组比较差异亦具有统计学意义(P<0．01，P<0．05)且表现出剂量效应关系；阳性组MDA含量明显高于阴性对照组(P<0．01)。高剂量组能显著降低MDA含量(P<0．01)，中、低剂量组与阳性组比较也有显著差异(P<0．01，P<0．05)，且存在剂量效应关系。

    在血清和肝组织中，MDA含量都随SOD活性增加而降低，两者间存在明显的负相关关系血清中r=-0．986，P<0．05；肝脏中r=-O．990，P<0．05)。

    2．4  小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与SOD活性、MDA含量的关系  小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与血清和肝脏中的SOD活性均成显著负相关关系(r血清=-0．998，r肝=-O．979，均为P<0．05)，与MDA含量均成显著正相关关系(r血清=0．997，r．肝=0．989，均为P=<0．05)。

    3  讨论  微核是反映机体接触致突变物和致癌物遗传毒性的敏感指标之一，本实验结果表明，不同剂量桑黄胞内多糖均能有效的抑制CP诱发的，骨髓细胞微核率，且存在剂量效应关系。当剂量为600 mg／kg时对微核的抑制率可达63．43％，说明桑黄胞内多糖可抑制CP引起的体细胞基因突变。精子畸形实验表明，高、中、低剂量的桑黄胞内多糖作用后，精子畸形率均较单纯CP作用组显著下降(P<O．01)，说明桑黄胞内多糖能抑制生殖细胞的基因突变。微核和精子畸形实验结果的一致性，进一步证明了桑黄胞内多糖具有明显的拮抗CP致突变作用。

    致突变物、致癌物等在造成机体损害或诱导细胞突变与癌变的过程中，可能与自由基生成有关。我们的研究结果显示，桑黄胞内多糖能显著增强机体SOD活性，降低MDA水平，该现象与微核细胞率明显相关。而SOD活性反映了机体清除氧自由基的能力，MDA含量则间接反映机体细胞受自由基损伤的程度【6】。因此，我们认为桑黄胞内多糖有可能通过增强机体抗氧化酶活性，降低组织中脂质过氧化产物水平，从而增强机体抗氧化防御系统的功能，减轻CP代谢产生的自由基可能引起的对细胞DNA的损伤，发挥抗突变作用。小实验结果也表明，血清和肝组织中的MDA含量均随SOD活性增强而降低，MDA含量与SOD活性之间存在显著负相关，验证了过氧化物浓度与抗氧化活性呈反比的规律【7-8】

    有报道称桑黄液态发酵菌丝体多糖主要成分为杂聚糖蛋白复合物，分子质量从9 000到l5000不等【9】。然而桑黄胞内多糖抗突变的具体组分及其构成以及确切机理还有待深入研究。桑黄因抗癌显著，其研究在韩国和日本很受重视，但目前国内对桑黄菌丝体的研究仅限于发酵【10】，所以桑黄液态发酵菌丝体的其他方面的药理研究及胞内多糖的分离纯化、结构分析也亟待开展。

    参考文献：

【 1 】 Ikekawa T，Nakanishi M，Uehara N，et al．Antitum or action of  Some basidiomycetes，especiallyPhellinus linteus[J]．Cann， 1968。59：155—157．

[2]郭倩，周昌艳．灰树花菌丝体多糖的提取【J1】食用菌，1998。(2)：10—11

【3]  张均田．现代药理实验方法【M】．第1版．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998．1 886-1 893．

【4]  汪旭，刘素清，合正基，等．抗着丝点抗体在鉴别微核起源上的应用【J】．癌变·畸变·突变，1994，6(2)：60—63．

[5】  刘毓谷．卫生毒理学基础【M】。第2版．北京：人民卫生出版社。1998．215—217．

【6]  Yavuzo O，Turkoakan N，Bilgihan A，et al．The effect of  2-chloroade nosine on lipid peroxide level during experimental   cerebral is ehemia-reperfusion ingerbils【J】Free Radic Riol．1997，22(4)：337-341．

【7】 Kristal BS，chen J，Yu BP．Sensitivity of mitochondrial  transcription to different free radial species【J】．Free Radic  Bio Med，1994，16(3)：323-327．

【8】李双莲，徐厚恩，尚兰琴，等．猕猴桃果汁抗环磷酰胺致突变作用及其机制【J】．北京医科大学学报，1998，30(3)：270—272．

【9】Lee JH，Hoon J，Cho SM，et al．Immunostimulating activity and  characterization of polysaccharides from mycelium of Phellinus  linteus[J】．J Microbiol Biotech。1996， 6(3)：213．

[10】郑立军，王清，沈业寿，等．药用真菌-桑黄的研究进展【J】．现代中药研究与实践，2005，19(3)：61-64．