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桑黄胞内多糖对白血病细胞K5
62的
增殖抑制效应研究
史新强／沈业寿*／卫
自／马金宝
(安徽大学生命科学学院、生化微生物研究所，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥
230039)
【摘要】背景与目的：观察桑黄胞内多糖(PLIP)对体外培养的人白血病细胞K562的增殖抑制作用，并初步探讨其作用机制。
材料和方法：采用MTT法及台盼蓝拒染法测定细胞增殖抑制率和生长曲线，Hoechst-PI双荧光染色，流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。
结果：PUP在25ug／ml、50ug／ml、loOug／ml、200ug／ml、400ug／ml、800ug／ml剂量时均能显著抑制K562细胞增殖(P<O．05)，其中400ug／ml剂量时抑制率最高，达52．55％，半数抑制浓度(IC50)为262．36ug／ml，流式细胞仪检测PuP在100ug／ml、200ug／ml、400
ug／ml剂量时K562细胞凋亡率分别为5．72％、13．57％、19．39％，并能诱导K562细胞出现凋亡所具有的形态学及生化特征。
结论：PUP对体外培养的人白血病细胞K562生长增殖具有明显的抑制作用，其作用机制可能与诱导K562细胞凋亡和影响细胞周期有关。
白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，主要采用化疗和骨髓移植来治疗，费用昂贵，毒副作用大，难以达到预期效果，而无毒副作用的天然中药已成为抗白血病药物研究的热点。桑黄是目前国际公认的抗癌效果最好的真菌［1］，具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗氧化、抗突变等多种药理活性［2-7］。对其药理作用的研究多集中在子实体多糖上，而对其胞内多糖的抗癌活性研究较少。液态发酵适宜工业化大规模生产，可以弥补子实体栽培周期长的不足。本室前期研究表明桑黄液态发酵产物胞内多糖对肝癌(HepG-2)、乳腺癌(：MCF-7)、宫颈癌(Hela)、S180等肿瘤细胞的体外生长增殖均具有显著抑制作用［6-7］，为了进一步探讨其抗肿瘤活性，本实验主要研究桑黄胞内多糖(phellinus
linteus intracellular polysaccharide，PLIP)对白血病细胞K562体外生长的影响，并初步探讨其作用机制。
1
材料与方法
1．1
材料
1．1．1
供试菌种桑黄菌株4．2303，安徽大学生化微生物研究所保藏菌种。
1．1．2
细胞
人白血病K562细胞株由中国科学技术大学免疫研究所惠赠。大鼠胰岛细胞按照文献[8]所述方法分离制备。。K562细胞和大鼠胰岛细胞用含10％胎牛血清的RPMI
1640培养液常规培养。
1．1．3
药品和试剂
桑黄胞内多糖PLIP按文献[6]中的方法提取制备；四噻唑蓝(MTF)、Hoechst33258和PI荧光染料均为Sigma，产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；RPMI
1640为Gibco公司产品；二甲基亚砜(DMSO)为中国医学科学院生物工程研究所产品。
1．1．4
仪器 MCLXL2型流式细胞仪为美国Coulter公司产品；C02培养箱为NBS公司产品；超净工作台为ESCO公司产品；倒置显微镜为莱卡公司产品；酶联免疫检测仪为华东电子集团医疗装备有限公司产品；24孔和96孔培养板为Coming公司产品。
1．2
方法
1．2．1
细胞生长抑制率的测定采用MTI'法［9］，设置正常细胞对照组(大鼠胰岛细胞)和K562细胞组，分别设O、25、50、100、200、400、800ug／ml．剂量的PUP，作用48
h后参照文献[12]处理细胞，用酶标仪在570nm波长下测定各孔吸光度值(OD)，按下式计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度。
细胞生长抑制率IR(％)=1-(实验组细胞OD值／对照组细胞OD值)×100％
1．2．2
生长曲线的测定采用台盼蓝拒染法［10］，取对数生长期细胞接种于24孔培养板中，加入PuP使其终浓度为50、100、200、400、800ug／ml，连续培养5
d，每天取3孔细胞，以台盼蓝拒染法计算活细胞数，取均值绘制生长曲线。
1．2．3
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期
取对数生长期的K562细胞，分别接种于5个培养瓶中，分别设空白对照组和100、200、400ug／ml
3个剂量组的PUP，作用48
h后，按照文献[11]所述方法上流式细胞仪检测，数据用软件CellQuesl和WinMDI
2．9进行分析并用直方图形式列出。
1．2．4
Hoechst-PI双荧光染色观察细胞形态［12］取对数生长期的K562细胞接种于培养瓶，设无药对照组和400ug／ml的plIP处理组，48
h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入VHoechst33258：PI=1：1的染液染色8
min，离心，弃上清，PBS吹打，混匀，涂片，荧光显微镜下观察拍照。
1．2．5
DNA琼脂糖凝胶电泳［10］
药物处理分组同1．2．3，作用48
h后，PBS洗3次，取5×106个细胞转移到1．5ml
EP管6000 r／min离心8
min，吹打均匀，加入SDS、250ul。混匀，55
℃水浴12 h，离心弃上清，加酚抽提，振10
min后，离心，抽取上清，加酚／氯仿／异丙醇抽提，离心，取上清，加入冷无水乙醇，析出DNA。含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察并摄影。
1．3
统计学方法
采用SPSS 13．O软件进行t检验，单因素方差分析，数据用x±s表示。
2
结果
2．1
PLIP对K562细胞的增殖的影响
结果表明PUP能增加K562细胞的增殖抑制率，与对照组比较差异具有统计学意义(P<O．05)，且在25～400ug／ml浓度范围内，呈量效关系；25ug／ml剂量时抑制率最低为21．8％，400ug／ml剂量时抑制率最高为52．55％，800
ug／ml．剂量的抑制率次之，为48．25％，并且(25～800)ug／ml浓度范围内对正常细胞生长无显著抑制作用(P>O．05)，见表1。同时，通过回归曲线测得PLIP对K562细胞的半数抑制浓度
(IC 50)为262．36ug／ml。
2．2
PLIP对K562细胞生长的影响
由图1可见，50ug／ml、100ug／ml、200ug／ml、400ug／ml、800ug／ml剂量的PUP与对照组相比能够明显抑制K562细胞生长，且这种抑制作用在50～400．ug／ml范围内呈现出时间和剂量依赖性，其中400ug／ml剂量对其生长的抑制作用最明显，这与MTT结果具有一致性 。
2. 3 PLIP对K562细胞周期及凋亡的影响
由表2可见正常生长的K562细胞大多数处于G0／G1期，凋亡细胞仅占2.01％，100ug/ml、200ug／ml、400
ug／ml的PLIP均可使K562细胞凋亡率上升G0/G1和G2期细胞下降，s期细胞上升，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，并且流式细胞仪分析的直方图上呈现明显的细胞凋亡峰亚G1期峰【图2】．提示诱导K562细胞凋亡，并将其阻滞于s期可能是PHIP抑制其体外生长增殖的原因之一
2. 4荧光染色结果
荧光显微镜下正常对照组细胞大小均一，染色质分布均匀，呈圆形或不规则椭圆形．发出均匀弥散的蓝色弱荧光。而400ug／ml剂量的PHIP作用K562细胞48
h后在镜下可见细胞皱缩、变形，染色质凝聚且边缘化，部分细胞体积变小并呈现DNA荧光碎片或出现浓染致密的块状和颗粒状强荧光，坏死细胞被Pl染色，呈现红色荧光，结果见图3
2．5
DNA 琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡
细胞凋亡时基因组DNA被特异性性酸内切酶水解成180bp及其倍数的片段，经DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯状条带。200
ug／ml、400
ug／ml剂量的PLIP作用K562细胞48
h后，电泳出现明显DNA梯形条带；而对照组和100ug／ml剂量下的K562细胞DNA完整，电泳仅有l条大分子带．结果见图4
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