桑黄胞外多糖药理活性的初步研究

郑立军，沈业寿，季俊虬，李宜明

(安徽大学生命科学学院糖复合物与糖工程实验室，安徽合肥230039)《食品科学》2007年28期

    摘  要：目的与方法：MTT法测定桑黄胞外多糖(PIEP)对肿瘤细胞增殖反应的影响，研究其体外抗肿瘤活性；采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和小鼠精子畸形实验，研究PIEP抗环磷酰胺(CP)致突变作用；通过测定创伤小鼠血清、肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，探讨其抗脂质过氧化作用。结果：PIEP能明显抑制肿瘤细胞的增殖，对肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7的半数抑制浓度(ic50)分别为194．42、261．5ug／ml；300、600mg／kg bw剂量的PIEP的微核抑制率可达44．78％和49．63％，各剂量组对CP诱发的精子畸形率也有显著抑制作用(p<0．01)；PIEP还能明显增强创伤小鼠SOD活性，降低MDA含量。结论：PIEP有明显的抗肿瘤活性和抗脂质过氧化作用，对由环磷酰胺引起的体细胞和生殖细胞的基因突变有着明显的拮抗作用。

    关键词：桑黄；胞外多糖；抗肿瘤；微核实验：精子畸变；脂质过氧化

     桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科的药用真菌，是目前国际公认的生物抗癌物质中有效率排在第一的药用真菌(其对小鼠肉瘤180的抑制率为96．7％)[1]。在《本草纲目》中就有其药用记载。桑黄子实体具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗氧化等多种药理活性【2．s】，价格昂贵，这也导致其野生资源遭到灭绝性开采。桑黄人工栽培周期长、难度大，且尚未形成规模，这就使得桑黄发酵的研究显得尤为重要。用发酵的代谢产物取代子实体提取物将是桑黄研究、应用的必然方向。为此，本文从抗肿瘤、抗突变和抗脂质过氧化三个方面初步探讨桑黄液态发酵胞外多糖的药理活性，为桑黄液态发酵产物相关的保健食品的研究提供实验依据。

    1  材料与方法

    1．1  供试菌株4．2303桑黄菌菌株由安徽大学糖复合物与糖工程实验室提供。  1．2  试剂胎牛血清杭州四季青公司；RPMl1640培养基Gibco公司；MTT(噻唑兰)、Giemsa染色剂、胰蛋白酶Sigma公司；二甲基亚砜  中国医学科学院生物工程研究所；氟尿嘧啶 天津金耀氨基酸有限公司；环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司；SOD、MDA试剂盒 南京建成 生物工程研究所。

    1．3  仪器    C02培养箱NBS公司；超净工作台ESCO公司；倒置显微镜 莱卡公司；酶联免疫检测仪 华东电子集团医疗装备有限公司：96孔培养板Corning公司。

    1．4  肿瘤细胞株肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7细胞株由中国科学院上海细胞库提供

    1．5  实验动物昆明种小鼠，体重20～2 4 g，雄性，安徽医研所提供，合格证号为皖医实动准第O 1号。

    1．6  方法

    1．6．1  桑黄胞外多糖的制备    桑黄一级摇瓶菌种接种到含葡萄糖3％，蛋白胨O．4％，MgS04·7H20 0．1％，KH2P04 0．1％的液体培养基中，28℃，1 30r／min培养一周后，离心得上清发酵液，将发酵液浓缩至小体积，加入3倍体积的95％乙醇4℃醇沉，离心、冷冻干燥即得胞外多糖(PIEP)【6】干粉。定性、定量测定采用苯酚－硫酸法。

    1．6．2  MTT法【⒎】

    将处于对数生长期的HepG－2和MCF-7细胞分别植于96孔培养板中，每孔100ul(5000个细胞／孔)，37℃、5％CO2培养箱孵育24h后，加入等体积不等浓度(100ul/ 孔)桑黄胞外多糖溶液(终浓度分别为800、400、200、100、50、25、12．ug／ml)和阳性对照药氟尿嘧啶(终浓度分别为3 20、1 60、8 0、40、20 u g／ml)，空白对照组加无血清RPMll640培养基(100u l／孔)，每组设6个平行孔。培养7 2h．后，弃上清，每孔加入MTT液(5 mg／ml)20ul后，继续培养4h后弃上清，加入DMSO(150ul／孔)，．用酶标仪570nm波长测各孔oD值，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度IC5o(细胞生长抑制率为50％的药物质量浓度)。

    细胞生长抑制率IR(％)=1-(实验组细胞OD值／空白对照组细胞OD值)×100

    1．6．3  小鼠嗜多染红细胞微核实验【8】

    实验小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组(C P组)，桑黄胞外多糖低、中、高三个剂量实验组，共5组，每组各l O只。阴性组、阳性组以O．2ml生理盐水灌胃；低、中、高剂量组分别灌以不同浓度的胞外多糖稀释液O．2ml，各组相当于1 50、300、600mg／kg，连续灌胃15d。实验最后2d，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg／kg，实验组在腹腔注射环磷酰胺40mg／kg 2h后，再分别灌胃胞外多糖稀释液O．2ml。末次给药后6h，处死小鼠，取一侧股骨。用小牛血清冲洗骨髓，混匀后直接推片，每只小鼠制片2张，标本编号。自然干燥后，甲醇固定，Giemsa与磷酸缓冲液(pH6．8)1：1 O混合后染色【3】。采用双盲法计数，每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核(MN)数【4】，计算微核千分率(MN‰)并按下列公式计算抑制率。

    MN抑制率(％)=(阳性组MN数-实验组MN数)×100／阳性组MN数。

    1．6．4  小鼠精子畸变实验【9】

    设阴性对照组，阳性对照组(CP组)，桑黄胞外多糖低、中、高三个剂量实验组，共5组，每组各1 O只。实验组分别经口灌胃胞外多糖稀释液O．2ml，各相当于150、300、600mg／kg，每天1次，连续7d，第8 d起同阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(40mg／kg)，每天1次，连续5 d。阴性组经口灌胃生理盐水，每天1次，连续5d给予CP后第35d处死小鼠，按常规方法制片，每只动物检查完整精子1 000个。不同畸形精子分类计数后，计算每组精子畸形率(‰)。

    1．6．5  小鼠血清、肝脏组织中SOD活性、MDA含量测定设阴性对照组，阳性对照组(CP组)，桑黄胞外多糖低、中、高三个剂量实验组，共5组，每组各1 O只。给药方式同实验方法1．6．3，末次给药后6h，摘眼球取血，离心分离血清；另迅速取出肝脏组织，按常规方法制成10％的组织匀浆液(组织：O．86％生理盐水=l：9)。SOD活性、、MDA含量、组织蛋白含量的测定按试剂盒说明进行。

    1．6．6  统计学方法

    实验数据用(x±s)表示，采用SPSS 10．O软件对数据作t检验，单因素方差分析，相关性分析。

    2  结果与分析

    2．1  桑黄胞外多糖对HepG-2、MCF-7细胞的抑制作用

    实验表明桑黄胞外多糖对肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7具有明显抑制作用，且在一定药物质量浓度范围之内，随着药物浓度的增加，抑制率逐渐增大，与空白对照组比较效果显著(p<0．01、p<0．05)，PIEP对HepG-2、MCF-7的抑制率最高可达50．51％和54．59％，半数抑制(IC50)浓度分别为194．42、261．56ug／ml，结果

见表1

    2．2  抗CP致突变作用

    2．2．1  桑黄胞外多糖对CP诱发的小鼠骨髓细胞微核率的影响CP组骨髓细胞微核率与阴性对照组的微核率差异极为显著(p<O．01)，说明CP能明显诱发微核产生。由表2显示，胞外多糖高、中剂量组的微核率CP组比较差异非常显著(p<0．01)，诱变抑制率达到49．63％和44．78％；低剂量组与CP组相比也有明显差异(p<o．05)。且随着胞外多糖剂量增加，抑制率也相应增加。

    2．2           桑黄胞外多糖对HepG-2和MCF-7细胞的抑制作用

       表2    桑黄胞外多糖对CP诱发的微核率的抑制作用

    2. 2. 1  桑黄胞外多糖对CP诱发小鼠骨髓细胞微核率的影响

    2．2．2  桑黄胞外多糖对cP诱发的精子畸形率的影响表3显示，cP组精子畸形率较阴性组明显增加(p<0．0 1)。而给予桑黄胞外多糖后，可使CP所诱发的精子畸形率明显下降。高、中、低剂量组与CP组相比，精子畸形率显著下降(p<0．0 1)，且随剂量增加，抑制作用越明显。而且胖头、双头或双尾等严重畸形的精子明显减少。

    2．3  桑黄胞外多糖对CP所致小鼠脂质过氧化的影响

由表4知，CP组SOD活性明显低于阴性对照组(p<0．0 1)，MDA含量明显高于阴性对照组，说明CP代谢生成的自由基明显引起了机体的的创伤，产生脂质过氧化作用。桑黄胞外多糖可显著增强血清和肝脏中SOD活性，显著降低MDA含量，各剂量组与CP组相比差异显著(p<O．01、P<0．05)，表现出明显的剂量效应关系。且MDA含量随SOD活性增加而降低，存在明显的负相关关系(血清中r=0．998、P<0。05；肝脏中r=-1．000、P<0．01)。

    3  讨  论

    桑黄是目前报道的抗癌效果最好的真菌，对其抗肿瘤方面的研究都集中在子实体多糖上，其机理是通过细胞调节和体液免疫来提高免疫力而抑制肿瘤细胞生长和转移[10】。本实验研究表明桑黄胞外多糖也具有明显的抗肿瘤活性，对肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7的抑制率都可达到50％以上。

    桑黄胞外多糖各剂量均能有效的抑制CP诱发的骨髓微核率，且存在量效关系。当剂量为600、300mg／kg时，对微核的抑制率可达49．63％和44．78％。精子畸形实验也表明，高、中，低剂量组与CP组精子畸形率相比都显著下降(p<O．01)。两抗突变实验结果的一致性，进一步证明了桑黄胞外多糖具有明显的拮抗CP诱发的体细胞和生殖细胞的基因突变作用。

    本实验结果还显示桑黄胞外多糖能显著增强创伤小鼠SOD活性，降低MDA含量。SOD活性反映了机体清除氧自由基的能力，MDA含量则间接反映机体细胞受自由基损伤的程度。可见桑黄胞外多糖能增强机体抗氧化酶活性，降低组织中脂质过氧化产物水平，减轻CP代谢产生的自由基可能引起的细胞损伤，发挥抗脂质过氧化作用。

    本研究为开发桑黄胞外多糖保健食品提供了实验数据。对其有效部位的抑瘤与抗突变机理还有待深入研究。

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