桑黄菌质多糖体外抑瘤及抗环磷酰胺致突变的作用

李宜明，沈业寿，季俊虬，郑立军

(安徽大学生命科学学院糖复合物与糖工程实验室，安徽合肥230039)

中  国  科  学  技  术  大  学  学  报2006年（第36卷第七期）

    摘要：采用MTT法研究桑黄固态发酵菌质多糖(PISPS)对肝癌细胞(HepG～2)、乳腺癌细胞(MCF～7)生长的抑制作用，测定出多糖对细胞生长的最高抑制率为59．1 8％、55．39％，半数抑制浓度为1 96．9、1 62．5ug／mL，且随药物浓度的增加抑制率有增大的趋势，与正常组比较作用较为显著(P<0．05)；选用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，对多糖的抗环磷酰胺(CP)致突变作用进行评价，结果表明桑黄菌质多糖使环磷酰胺诱发的细胞微核率和精子畸形率明显降低(P<O．01)．

    关键词：桑黄；多糖；肿瘤细胞；微核试验；精子畸形

    引言

    桑黄(Phellinus igniarius)属于担子菌亚门，多孔菌科的药用真菌，因其多种药用功能特别是在肿瘤、抗突变方面的作用，已成为国内外研究的热点[1]．桑黄及其发酵菌丝体含有多糖、蛋白质、氨基酸、萜类、酶类等多种成分，有报道称桑黄菌质多糖(PISPS)是其抗癌、抗突变的主要成分［2］，已有体内抑瘤实验证明，桑黄子实体水提物可诱导癌细胞进入细胞程序死亡，对小白鼠肉瘤S-1 80的抑制率为96．7％［3］，对艾氏腹水癌的抑制率为80 %，但对PISPS的抗肿瘤功效尚未有报道．本实验应用MTT法，研究PISPS对较为普遍和多发的肝癌、乳腺癌的抑制作用．目前，乳腺癌细胞MCF一7、肝癌细胞HepG-2已广泛应用于体外抑瘤实验，被认为是较为合适的检验药物抗肿瘤作用的靶标[4］；同时，参照国内外实验研究采用修改的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验进行抗突变功能评价[5]，以小鼠骨髓细胞微核率、小鼠睾丸染色体畸形率为观察指标检验PISPS在抗突变方面的功效．

1材料和仪器供试菌株桑黄菌株编号为4．2302，由糖复合物与糖工程实验室提供．

药品和试剂  胎牛血清：杭州四季清生物工程材料有限公司产品；RPMI一1 640、MEM培养基：Gibco公司产品；MTT：Sigma公司产品，使用前用PBS配制成质量浓度为5 mg／mL；DMSO：中国医学科学院生物工程研究所提供；5-Fu：天津金耀氨基酸有限公司产品；GiemlSa染色剂：Sigma公司产品．环磷酰胺：江苏恒瑞医药公司产品．

    肿瘤细胞株  中国科学院上海细胞库提供HepG—2；中国科学技术大学神经毒理学实验室提供MCF-7．    ．

    实验动物  昆明种小鼠，体种为20～24 g，雄性，安徽省医研所提供．随机分组，每组10只．．

    仪器和设备  C02培养箱：New BrunSWick Scientific公司产品；超净工作台：ESC()公司产品；倒置显微镜：Leica公司产品；酶联免疫检测仪：华东电子集团医疗有限公司产品．

    2实验方法

    2．1桑黄菌质多糖的制备

    将桑黄菌液态培养得到的菌球匀浆后，以5 ml的接种量接到固态培养基中，室温条件下静置培养两星期．待菌丝体长满培养基后，按文献[6]所报道的方法制取多糖[6］，

    2．2体外抑瘤实验

    运用改良的MTT实验[7］计算细胞存活率、细胞生长抑制率和半数抑制浓度．PISPS组终质量浓度分别为800、400、200、1 00、50、25、12．5ug／mL，阳性对照组加5-FU使其终质量浓度分别为320、l 60、80、40、20ug／mL，每个剂量均设6个平行孔．细胞存活率(％)＝实验组细胞OD值/空白对照组细胞OD值×100％细胞生长抑制率IR(％)＝1－ 实验组细胞OD值/空白对照组细胞OD值×100％  半数抑制浓度(IC50)＝细胞生长抑制率为50％的药物质量浓度［4］若IR>70％为高度敏感，IR>50％为中度敏感，IR<50％为不敏感．统计学方法：每份标本平行测定6孔，求其平均数±标准差，采用SPSS软件方差分析，t检验，每个药物实验组与空白对照组比较．

    2．3小鼠骨髓细胞微核实验

    健康昆明小鼠50只，体重为20～24 g，随机分为5组，每组10只．设阴性对照组，阳性对照组(CP组)和PISPS高、中、低3个剂量组．阴性组、阳性组以0．2 ml生理盐水灌胃，高、中、低剂量(相当于500、250、125 mg／kg)组分别灌以不同浓度的样品稀释液0．2 mL，连续1 5天．其中在试验最后2天，阳性对照组和PISPS组分别腹腔注射CP 40mg／kg，并于腹腔注射CP 2h后，再恢复正常灌胃．末次给药后6 h，小鼠断颈处死，取一侧股骨，用小牛血清冲洗骨髓，混匀后直接推片，每只小鼠制片2张，标本编号．自然干燥后，甲醇固定．1：1 0 GiemsapH6．8磷酸缓冲液染色．采用双盲法计数，每只小鼠计数1 000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核(MN)数，求出微核千分率(MN‰)和抑制率，采用SPSS生物统计软件进行统计分析，t检验．抑制率(％)=(阳性组MN数一实验组MN数)×100／阳性组MN数．

    2．4小鼠精子畸形实验

    健康昆明小鼠50只，体重为20～24 g，随机分为5组，每组10只．设阴性对照组，阳性对照组(CP组)和PISPS高、中、低(相当于500、250、125 mg／kg)3个剂量组．实验组分别经口灌胃样品稀释液0．2ml，每天1次，连续7天，第8天起与阳性组对照组一起腹腔注射环磷酰胺40 mg／kg，每天1次，连续5天．阴性组经口灌胃生理盐水，每天1次，连续5天．首次给予CP后第35天，以颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹膜，取出睾丸，分离附睾，按Wrobek方法制片［8］．高倍镜下检查精子形态，每只动物检查完整精子1 000个．精子畸形的类型有无勾、无定性、香蕉形、双头、双尾以及胖头［9］．无尾精子、头部重叠的或整个精子与另一个重叠的均不计数．不同畸形精子分类计数后计算每组精子畸形百分率．采用SPSS生物统计软件进行统计分析，t检验。

    3  结果

    3．1 PISPS的体外抑瘤作用

    MCF-7、HepG-2的实验结果表明PISPS对MCF-7、HepG-2具有明显抑制作用，且在一定药物质量浓度范围之内，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增大，与空白对照组比较效果较为显著(P<0．05)．见表1、表2．同时，通过回归曲线测得PISPS的半数抑制质量浓度见表3．

 表1 PISPS对MCF-7的抑制作用