桑黄子实体水提物抗肿瘤和抗环磷酰胺

致突变作用研究

王  清1  沈业寿2  赵浩如3

     (1合肥立方制药有限公司，合肥230088；2安徽大学生命科学学院，合肥230039；3中国药科大学，南京210009)

《食用菌》杂志2006年第五期

  摘要 采用体外抑瘤实验研究人工栽培的桑黄菌子实体水提物(PSW)对肝癌细胞(HepG-2)、乳腺癌细胞(MCF-7)生长的抑制作用；选用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，研究了PSW的抗环磷酰胺致突变作用。结果：PSW对HepG-2、MCF-7有很好的抑制作用，对环磷酰胺诱发的微核率和精子畸形率有着显著的抑制作用(P<O．01)，并能明显增强小鼠血清和肝组织中SOD活性，降低MDA含量。

关键词   桑黄水提物  肿瘤细胞株  微核试验  精子畸形

    桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科的药用真菌，其药用最早记载于《本草纲目》中。近年来，桑黄因其多种药用功能特别是在抗癌方面的作用，已经成为国内外研究的热点【1-3】。在我国，桑黄子实体的来源以野生为主，人工栽培刚刚起步。本实验采用MTT法研究人工栽培的桑黄子实体水提物的体外抗肿瘤作用同时研究了抗环磷酰胺(CP)致突变作用。通过测其对细胞生长抑制率、存活率、半数抑制浓度以及创伤小鼠血清和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等，探讨人工栽培桑黄子实体的药用价值。

l材料与方法

1．1材料

1．1．1桑黄予实体由金寨县桑黄菌开发有限公司提供。

1．1．2药品和试剂①胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)；②RPMI1640培养基((Giboo公司产品)；③MEM培养基((Giboo公司产品)；④MTT(噻唑兰)：Sigma公司产品，使用前用PBS配制成质量浓度为5mg/ml，；⑤DMSO(二甲基亚砜)：中国医学科学院生物工程研究所；⑥5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；⑦胰蛋白酶(Sigma公司产品)；⑧环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；⑨sOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)；⑩MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；⑾Giemsa染色剂(Sigma公司)；⑩生理盐水(安徽双鹤药业有限公司)。

1．1．3肿瘤细胞株①HepG-2(中国科学院上海细胞库)；②MCF-7(中国科学技术大学神经毒理学实验室)。

1．1．4实验动物昆明种小鼠，安徽医研所提供，20～24 g，雄性，随机分组。每组10只。

1．1．5仪器和设备①Co培养箱；②超净工作台；③倒置显微镜；④酶联免疫检测仪；⑤96孔培养板。

1．2方法

1．2．1 PSW的制备称取子实体250 g，加入750 mL水，75℃水浴提取2 h，离心取上清液，重复3次。合并上清液，减压浓缩，透析，冷冻干燥后即得PSW。

1．2．2 MTI’法取对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后吹打成细胞悬液，浓度为6～8×10 4个／mL，，加入96孔培养板中，每孔100ul，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24 h。将制备的样品加到96孔板中，每孔100ul/ml。使终质量浓度分别为800ug/ml。，400ug/ml。200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12．5ug/ml每个剂量设6个平行孔。空白对照组加完全培养液100,ul。，阳性对照加5-FU使其质量终浓度分别为320ug/ml，160ug/ml，80ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，每个剂量设6个平行孔，置于37℃、5％Co2培养箱中继续培养48 h。快速翻板法弃上清液，每孔加MTT(5 mg/mL)20uL，继续培养4 h，每孔再加DMSO 100,ul，用微量震荡器震荡10 min，用酶联免疫检测仪检测每孔吸光度值，检测波长为570 um，参比波长为490um。计算细胞存活率、细胞生长抑制率、半数抑制浓度等。

    细胞存活率(％)=(实验组细胞0D值／空白对照组细胞OD值)×100％

    细胞生长抑制率IR(％)=1-(实验组细胞OD值／空白对照组细胞OD值)×100％

    半数抑制浓度(IC50)=细胞生长抑制率为50％的药物质量浓度若IR>70％为高度敏感，IR>50％为中度敏感，IR<50％为不敏感。   

1．2．3微核实验【4】  设阴性对照组。阳性对照组(环磷酰胺组)和PSW高、中、低3个剂量组。共5组。阴性组、阳性组以0．2 ml，生理盐水灌胃，高、中、低剂量组分别灌以不同浓度的Psw稀释液O．2 ml，(相当于500 mg／kg．bw、250 mg/kg，bw、125 mg/kg．bw)，连续15 d。试验最后2 d，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40 ng/kg．bw，实验组在腹腔注射环磷酰胺40 mg／kg．bw2 h后，再分别灌胃样品稀释液0．2 ml。末次给药后6 h，小鼠断颈处死，取一侧股骨，用小牛血清冲洗骨髓，混匀后直接推片，每只小鼠制片2张，标本编号。自然干燥后，甲醇固定，1：10 Gimasa pH 6．8磷酸缓冲液染色【5】。采用双盲法计数，每只小鼠计数1 000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核(MN)数，求出微核千分率(MN‰)和抑制率。

    抑制率(％)=(阳性组MN数～实验组MN数)×100／阳性组MN数  、

1．2．4小鼠精子畸变实验【6】  设阴性对照组，阳性对照组(环磷酰胺组)和PSW高、中、低3个剂量组，共5组。实验组分别经口灌胃样品稀释液0．2 ml。，各相当于500mg/kg．bw、250mg／kg．bw、125 mg/kg．bw，每日1次，连续7 d，第8 d起与阳性组对照组一起腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg．bw，每日l次，连续5 d。阴性组经口灌胃生理盐水，每天1次，连续5 d。首次给予环磷酰胺后第35 d处死小鼠，按常规方法制片，每只动物检查完整精子1 000个。计算精子畸形率‰。

1．2.5  小鼠血清、肝脏组织中SOD活力、MDA含量测定设阴性对照组，阳性对照组(环磷酰胺组)和PSW高、中、低3个剂量组，共5组。阴性组、阳性组以O．2 ml 生理盐水灌胃，实验组分别灌以不同浓度的样品稀释液O．2 mL(相当于500mg/kg．bw、250 mg/kg．bw、125 mg/kg．bw)，连续15 d。试验最后2 d，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg．bw。，实验组在腹腔注射环磷酰胺40mg/kg．bw 2 h后，再分别灌胃样品稀释液0．2 mL。末次给药后6 h，摘眼球取血，离心得血清。迅速取出肝脏组织，按常规方法制成10％的组织匀浆液(组织：0．86％生理盐水：1：9)，测定超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量。测定按照南京建成生物工程研究所提供的产品说明书进行。

1．2．6统计学方法  采用SPSS软件方差分析，t检验，每个药物实验组与空白对照组比较。

2实验结果

2．1 PSW对乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制作用  结果表明PSW对MCF-7具有明显抑制作用，且在一定药物质量浓度范围之内，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增大。与空白对照组比较效果较为显著(P<O．01)，见表1。

 2．2 PSW对肝癌细胞(HepG-2)的抑制作用  结果表明PSW对HEPG-2具有明显抑制作用，且在一定药物质量浓度范围之内，随着药物质量浓度的增加，抑制率逐渐增大。其中400 ug/mL PSW对细胞的生长抑制作用最大，与空白对照组比较效果较为显著(P<O．01)，见表2。

2．3 PSW的半数抑制质量浓度通过回归曲线测得PSW对两种肿瘤细胞的半数抑制质量浓度，结果见表3。

2．4 PSW对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核率的影响由表4可知环磷酰胺阳性组微核率与生理盐水对照组的微核率差异极为显著(P<O．01)，PSW对环磷酰胺诱发的微核细胞率有明显的抑制作用，微核细胞率与环磷酰胺组相比有非常显著差异(P<O．01)。根据各组的微核细胞率，计算出各实验组的抑制诱变率，PSW低、中、高剂量组分别为29．85％。55．97％和67．16％，且有明显的剂量效应关系。

2．5 PSW对环磷酰胺诱发的精子畸形率的影响PSW各剂量组小鼠精子畸形率较阴性对照组有所增加，但较阳性对照组低，其差异非常显著(P<O．01)，说明PSW具有明显的拮抗环磷酰胺诱发的精子畸变的作用(见表5)。

2．6 PSW对环磷酰胺所致小鼠脂质过氧化的影响

2.6．1  对血清中SOD活力和MDA含量的影响  由表6知，给予环磷酰胺的阳性对照组的小鼠血清中SOD活力明显低于阴性对照组(P<O．01)。各剂量组随着剂量的增加SOD活力明显增强。PSW各组与阳性对照组比较差异显著(P<0.01)且成明显的量效关系；阳性组MDA含量明显高于阴性对照组(P<O．01)，说明给予环磷酰胺的剂量足以对机体产生致突变作用。PSW各剂量组MDA含量逐渐减少，且与阳性对照组比较有显著性差异(P<0．01)，成明显的量效关系。

2．6．2  对肝脏中SOD活力和MDA含量的影响  由表7知，PSW各剂量组肝脏组织中SOD活力均明显高于阳性组，且差异显著(P<O．01)，成明显的量效关系，说明PSW均能显著增强肝脏中SOD活力，从而拮抗环磷酰胺的致突变作用。阳性组MDA含量明显高于空白对照组(P<O．01)，可知环磷酰胺对机体产生了明显致突变作用。PSW各剂量组MDA含量逐渐减少，且与阳性对照组比较有显著性差异(P<O．01)成明显的量效关系。

3讨论

    桑黄菌是近年来兴起的一种药用真菌，其抗肿瘤的功效在古时就有报道，国内外也对桑黄的抗肿瘤作用有着密切的关注。从本实验结果可以看出，人工栽培的桑黄子实体提取物对两种肿瘤细胞有很好的生长抑制作用，且两个细胞株对子实体提取物质量浓度为800ug/mL、400 ug/mL、200 ug/ml，3个剂量表现为中度敏感(IR>50％)。PSW各剂量均能有效的抑制环磷酰胺诱发的骨髓微核和精子畸形等遗传损伤，并均呈量效关系，证明了人工栽培的桑黄子实体提取物具有抗致突变作用。进一步研究提示，PSW能显著诱导机体SOD活性，降低MDA水平，且与微核细胞率和精子畸形率明显相关。因此，我们认为桑黄有可能通过增强机体超氧化物歧化酶的活性，降低组织中脂质过氧化产物的水平，从而增强机体抗氧化防御系统的功能，发挥抗环磷酰胺致突变作用。本研究为桑黄申报抗致突变类保健食品提供了科学的依据。

    参  考  文  献

[1]  Ikekawa T，Nakanis hi M，Ue hara N，et al．Antitumor action of

    basidiomyeetes，especially P hellinus linteus[J]．Gann,1968

   some basidiomycetes, especially  P hellinus linteus [J] Gann ,1968 ．

    59：155—157．

[2]  Sasaki T，Flujii K，Sugura M，et al．Antiturnor polysacc harides from

    some polyporaceae，Ganderma applanatum(Pets．)Pat and P heli